HLA解析パイプライン

【作成方法詳細】 

1. OS：Ubuntuをインストール　（DockerやWSL等は推奨いたしません。）

　　・詳細はWEBで他ホームページを参照し、行ってください。

　　　Ubuntu24.04LTS　USBインストールメディア　を作ろうで検索

　　・インターネット接続をする。

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  2. Miniconda3をインストール

       OSにもminicondaが必要ですが、別にGalaxy　projectが利用する、miniconda3のインストールが必要です。

       詳細はで他ホームページを参照し、行ってください。

   　Linux　64-bit をAnacondaホームよりダウンロード、→　自身のPC　ダウンロードフォルダーに格納されている 

       ので　ダウンロードフォルダ-内で　右クリックし、端末で開くを選択（ターミナルを開く）

                            $ bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh　

　   を入力実行　＄マークはターミナルに初期入力されているので入力しないこと。

       続くと表示されますので　enter　長押し　で　YES　or　NOが表示されるまで　長押し

　　YESで

　　home／ユーザー名／　で展開されます。Miniconda3のフォルダーが出来ていることを確認

​

  3. Galaxy　Projectをインストールしてください。

       ／home／ユーザー名／　　に入り　端末（ターミナル）を開く​

       miniconda3 のバージョンを確認

​       python -V  を実行

　　3.8以降が必要です。

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　　インストール詳細は、https://galaxyproject.org/admin/get-galaxy/　を参照

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　　ターミナルで以下を実行

　　　git clone -b release_24.1 https://github.com/galaxyproject/galaxy.git

　　　エラーが表示された場合は、＄の重複またはgitをインストールする。gitのインストール方法はググって

　　　ください。

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　　アップデート

　　　git fetch origin && git checkout release_24.1 && git pull --ff-only origin release_24.1

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　　　／home／ユーザー名／　　内にGALAXYフォルダーが出来ます。

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　4.　​ＩＧＶをインストールして下さい。（Javaの更新が必要な場合があります。）

　　　／home／ユーザー名／　に更に　IGV　LINUX　をインストールして下さい。

　　　　詳細は　ＩＧＶ　ｌｉｎｕｘをインストールで　　ググってください。

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　5.　GALAXYフォルダーをクリックし　Configフォルダーを更にクリック

　　　Galaxy.yml.sample　ファイルを探し、コピーを同じフォルダー内に作る。

　　　コピーのyml.sampleファイル内に入り、

　　　＃admin_users　と書かれた行を探す。（1730行目あたり）

　　　＃を消し、admin users:　info＠hgla.com　などの貴方のユーザー名を記述　　　

　　　保存してください。

　　　修正した　yml.sample　ファイルを　.sample　を消し　galaxy.yml　と書き換えファイルを保存。

　　　念の為、PCを立ち上げなおしてください。

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　6.　／home／ユーザー名／　　に入り、GALAXYフォルダーに入ります。

　　　右クリックで端末（ターミナル）を開き

​　　　sh_run.sh　　を実行

​

　7.　しばらく（1-2分放置）した後、Webブラウザーのfirefoxを開き、

　　　localhost:8080　　を入力実行

　　　GALAXYの画面が展開されていれば成功。​

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　8.　ユーザーメニューより　Ymlファイルで設定したIDでAdminでのログインをして下さい。

​​​​　　　パスワードの設定が必要​

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​　9.　必要となるプログラムを管理者画面より　インストールしてください。

　　　・filtlong

　　　・map with minimap2

　　　・samtools phase

　　　・samtools fastx

　　　・flye

　　　・medaka consensus pipeline

　　　・NCBI　Blast

​　　　　　　プログラムによりインストール時間が長いものも存在します。気長に対応してください。

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​　　　　　　　　　　Install　and　anistall

​　　　　　　　サーチにprogram名を入れてさがし、install実行

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　　　　GALAXYの使用法は、他WEBホームページでも探すことができます。他のもので使用方法を参照して

　　　　使いかたに慣れてください。

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　10.　BLASTで利用するデータベースの作成

　　　Git-hubよりIMGT-HLAの最新の　hla_gen.fasta.zipデータをダウンロードし、Galaxyにロードしてください。　　

　　　NCBI　blast　Make　data-baseプログラム　でgen　fastaをblast用データベースに変換してください。

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​　　　git　IMGT　HLA　でWEB　検索

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　　　　　リストより　　Hla＿gen.fasta.ZIP　をダウンロード

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​　　　　　Hla＿gen.fasta.ZIPをgalaxyにupload

​　　　　　　Upload　data　で選択し　STARTでupload

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​　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Uploadされたデータ

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　　　NCBI　BLAST+　makeblastdb　プログラムを選択し、

　　　　　　　　　　　　Molecule　type　of　input　で　nucleotideを選択チェック

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​　　　　　　　　Execute　でblast用データベースに変換

　　　　　　　　　　　　出来たデータベースのデータの鉛筆マークをクリックし、バージョンなどわかりやすい

　　　　　　　　　　　　名前に修正してください。　　元のzipデータはGALAXYから削除してください。

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　11.　弊所に修正したchr6.fastaをメールで要求してください。（info@hgla.jp）お送りいたします。

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　12.　chr6.fastaファイルをGalaxyにロードしてください。Upload　dataで

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　13.　HLA-A,B,C,DRB1,DPB1,DQB1,DPA1,DQA1等のナノポアデータをご準備ください。

　　　　生データをお持ちでないなら、デモデータを弊所にメールで要求してください。

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　14.　HLAナノポア生データをGalaxyにアップロードしてください。

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　以下操作は、ワークフローを作成する為上手く稼働したものを1個づつ残して、良くなかった操作は消してくだ

　さい。

　バージョン違いで稼働しないかもしれませんが、まず弊所にワークフローのプログラムを要求して、

　ワークフローを　Galaxyにimportし、利用できるかお試しください。

　利用できれば、かなりの省力化になります。（　info@hgla.jp　）

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　15.　プログラムFiltlongでデータの選別をしてください。

　　　（ただし、filtlongはあまり必要としません。再計算する時には便利となる場合があります。）

　　　Input　FASTQに生データを選択

　　　Output　thresholds　でmin長さ　を　3000位などするなど断片プロダクト削除しておく

 

 

　　　その他パラメーターはデフォルトで実施

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Excuteで実行

　

　16.　Map　with　Minimap2でマッピングを行ってください。

　　　will you select a reference genome from your history or use a built-in index? で　

　     　　　Use a genome from history and build index を選択

　　　Single read を選択

　　　Select fastq datasetで　生データを選択

　　　Select a profile of preset options で　

　　　　　3番目のoxford　nanopore　read　to・・・・　　を選択

　　　Index　option　で　k-mer　18.0に設定

　　　その他はデフォルト　　　　　　　　　　　　　　　ＥＸＣＵＴＥ　で実行

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　17.　Samtools　phaseでフェージング（相分離）をして下さい。

　　　先の処理でのBAMファイルが選択されているはず。

　　　Phase　parameters　は、advancedを選択し、Read　depthに気を付ける。

　　　ナノポアシーケンスは能力が高く、件数が少ないと、depthが1000を超えることが多々あります。

　　　Read　depthの値は、生データBAMのdepth数よりも大きく設定していなければ、うまくフェー

　　　ジングできません。よって、depthはまず1024位に設定してください。

　　　生データBAMのdepthが100~300位で安定したら、設定を256または512に変更してください。

　　　Minimum　base　quality　to　be　used　in　het　calling　を

　　　弊所では　　11　に設定しています。

　　　その他パラメーターはデフォルト使用　　　　　　　　ＥＸＣＵＴＥ　で実行　

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　18.　分離されたBAMをSamtools fastxでfastaファイルに変換（Phase0、Phase1と2つあります）

　　　Phase0　と　phase1のBAMファイルをfastaファイルに変換

　　　順番は0から1の順にやっていってください。

　　　決めた順に実行しないと、あとでワークフローがもつれます。　　　　　ＥＸＣＵＴＥ　で実行

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　19.　Flyeにてコンセンサスを作成

　　　MODE　で　　　nanopore　corr　　選択

　　　Number　of　polishing　で　　4　入力

　　　その他変更なし　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＥＸＣＵＴＥ　で実行

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　20.　Medaka　consensus　pipline にてコンセンサスの修正（phase0とphase1をそれぞれ2回実施）

　　　Select　basecalls　　　phase0からのfastaを選択

　　　Assembly　　　　　　phase0からのconsensusを選択

　　　Model　　　　　　　r1041　フローセルのバージョン

　　　　　　　　　　　　　FAST　hac　SUP　　ベースコーラーの種類

　　　　　　　　　　　　　Variant　を選択

　　　　　　　　　　　弊所は　r1041　e82　400bp　sup　variant　g615を選択しています。

　　　　　　　　　　　ここは吟味する必要があるかもしれません。

　　　Output　file　　　consensus　のみとしています。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＥＸＣＵＴＥ　で実行

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　21.　もう一度　Medaka　consensus　pipline にてコンセンサスの修正

　　　ここで各座のコンセンサスシーケンスが出来ている。

　　　データタブの右上にある👁をクリックするとcontig1~4など各座のコンセンサスシーケンスがあるので

　　　このあとにこのPC上で実行するblastで100％マッチではない、ミスマッチ、ギャプなどがあれば　

　　　ここのデータをコピーして、WEBでNCBI　blastを実行することも可能

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　22.　NCBI　blast+　blstnで判定

　　　Phase0　および　　phase1からの　コンセンサスシーケンスを判定する。

　　　Megablast　

　　　Tubular（select　which　columns）

　　　　Standard　columnsでチェック

　　　　　　　qseqid

　　　　　　　sseqid

　　　　　　　pident

　　　　　　　length

　　　　　　　mismatch

　　　　　　　gapopen

　　　　　　　evalue

　　　　　　　bitscore

　　　　extend　columnsでチェック

　　　　　　　salltitles

　

　　　Ａｄｖａｎｃｅｄ　optionsで　

　　　　　　　Percent　identity　cutoff　　を　　99.6％　に設定

​

　23.　1連でうまくいったら、今までの操作をワークフローで保存し、そのあとワークフローを修正する。

　　　

　　　画面右上　　▼　　をクリック

　　　　　　■ワークフローを抽出　　をクリックでワークフローが保存されます。

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​　　　　　　　保存されたワークフローのnameをクリックし、EDITでワークフロー図を確認修正

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　　　　　　次回からは、ワークフロー操作で半自動で解析が終了します。1検体7~10分間

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​　　判定データの確認

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​　　　　　　　　　　　　　Megablast　データカラム　👁マークをクリックするとblast結果が表示

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​　Blast結果の見方

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​　　　４座の場合Contig1-4で表記　マッチ％　アライメント長　　　　　　　登録アレルの長さ

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　　　　　　　　　　　　　　　ミスマッチの数　　ギャップの数

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　　　　　登録アレル長とアライメント長が同じで、ミスマッチ0、ギャップ0のとき

　　　　　8桁で確定。　　上記結果は　　HLA-C*03：04：01：02と判定。

　　　　　

　　　　　スクロールで下を参照していけば、次のcontig結果が参照できる。

　　　　　Contigのトップにあるからそれが結果とは限らない　アライメント長がやや短いもので

　　　　　ミスマッチ0、ギャップ0となっていても、やや下の所に　アライメント長が長くミスマッチ0

　　　　　ギャップ1などがある場合は、同点の可能性があります。

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　　　　　ミスマッチ1やギャップ1などがあった場合、イントロンの場合は6桁報告できるが、

　　　　　エクソンである場合は、4桁も怪しくなる。クラスⅠではミスは少ないが、DRB1は多々

　　　　　ギャップやミスマッチが認められます。特にイントロン2の特定箇所（２塩基反復配列）

　　　　　その場合、Medaka　consensusのデータカラムから該当のcontigの配列を参照し、

　　　　　WEB上でNCBI　BLASTにいく　クラス１　A,B,CはNCBI内では登録データが少なくこれを

　　　　　実行してもあまりよい結果が得られません、クラスⅡの確認に適しています。

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　　　　　　　Medaka consensus データカラムから　👁をクリック　該当のcontigの配列をコピー

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​　　　　　WEB上　NCBI　BLASTに行く　　Nucleotide　BLASTをクリック　

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​　　　　　　　ここに配列をペースト

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​　　　　　　　　　データベース　CORE―ntで　　BLAST実行

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​　　　　　　　　　上位のDRB1で6桁報告されているものを選択クリック

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​​　　　　　　

　　　　　　　　アライメント結果が表示されますが、エクソン、イントロンが解りません。

　　　　　　　　　　　

​　　　　　　　　　　　　　　　Graphicsをクリック

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　　　　　　　リファレンスとのアライメントで青線ギャップ　、赤線ミスマッチがどの位置に

　　　　　　　あるか表記されます。　Blastの結果を考慮して、イントロン内なら6桁報告可能、

　　　　　　　エクソン内なら判定不能となります。

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　　　IGVでのデータ確認　　

　　　　　　　フェージングやコンセンサス配列の信頼を確認する為、IGVでデータを確認します。

　　　　　　　GALAXY内　　　Samtools　phase　on　data　　phase0readsのbamファイルと

　　　　　　　Phase1のBAMファイルをIGVで確認しておくことが重要です。

　　　　　　　それぞれのGalaxy内データカラムの左下にフローッピーマークがありクリックすると

　　　　　　　PCのダウンロードフォルダーにダウンロードされます。　IGVでフェージング、

　　　　　　　エクソン内を中心に読み取り配列が不明瞭なものがないかを確認してください。

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　　　　　　　　　おつかれさまでした

　　　　　　　　　最後までお付き合いして頂きありがとうございます。​​​​​

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